Fast alle Vorgänge in mehrzelligen Organismen werden durch ein –im Optimalfall perfektes- Zusammenspiel zwischen einzelnen Zellen bestimmt. Die Kommunikation zwischen Zellen (Signaltransduktion) kann zu sehr dynamischen Prozessen wie Zellteilung, Endo- und Exocytose sowie Bewegung (Migration und Invasion) von Zellen führen. Zu den beweglichsten Zellen des menschlichen Organismus zählen die Immunzellen, die durch Chemokine an den Ort der Infektion gelockt werden. Aber auch Nervenzellen (Neurone), Knochenzellen (Osteoblasten, Osteoklasten), Haut- und Bindegewebszellen sind sehr beweglich. Während der Migration erfolgt eine steter Auf- und Abbau des Zytoskeletts, das aus Intermediär- und Aktinfilamenten sowie aus Mikrotubuli besteht. Die treibende Kraft für die Migration wird durch die Dynamik der Aktinfilamente bereitgestellt. Hierbei werden am vorderen Ende der Zellen Aktinfilamente auf- und am hinteren Ende abgebaut. Diese Dynamik der Aktinfilamente wird durch Aktinbindeproteine kontrolliert. Mikrotubuli dagegen regulieren hauptsächlich die Bewegung von Spindelfasern und den Transport von Vesikeln. Deshalb sind die Zellteilung und die Proteinsekretion zum Großteil durch Mikrotubuli gesteuert. Ähnlich wie bei Aktinfilamenten, wird die Mikrotubuli-Dynamik durch assoziierte Proteine reguliert.

Ist die Regulation und/oder Bindung von Zytoskelett-assoziierten Proteinen gestört, kann es zu Störungen der Zellphysiologie kommen. Dies ist besonders bei Autoimmunkrankheiten, neuronalen Störungen und bei metastasierenden Tumorzellen von großer Bedeutung. Aus diesem Grund ist es ein sehr interessanter Ansatz nach Zytoskelett-assoziierten Proteinen zu suchen, die essentiell für die Funktion von Immunzellen, Neuronen und Tumorzellen sind. Je nach Krankheitsbild sollte eine Stimulation oder Hemmung dieser Proteine die Störung abschwächen.

Unsere Gruppe untersucht hauptsächlich die Funktion von Zytoskelett-assoziierten Proteinen bei der Metastasierung von Tumorzellen. Es gelang uns bereits Proteine zu identifizieren, die an der Regulation dieser Prozesse beteiligt sind. Unter diesen Proteinen wurde die Inositol-1,4,5-trisphosphat 3-Kinase-A (ITPKA) besonders gut untersucht. Darüber hinaus interessieren wir uns generell dafür wie das Zytoskelett von Tumorzellen reguliert wird. Ein genaues Verständnis darüber ermöglicht es, die Zytoskelett-Dynamik in Tumorzellen zu hemmen und damit die Metastasierung von Tumorzellen zu blockieren.

Im Folgenden sind kurz unsere aktuellen Projekte zusammen gefasst:

Inositol-1,4,5-trisphosphat 3-Kinase-A (ITPKA)

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Wir forschen bereits seit mehr als zehn Jahren an der Rolle der physiologisch nur in Neuronen exprimierten Inositol-1,4,5-trisphosphat 3-Kinase-A (InsP3Kinase oder ITPKA) bei der Tumorgenese. Umfangreiche Untersuchungen ergaben, dass ITPKA in Lungenkarzinomzellen überexprimiert ist und die Metastasierung dieser Zellen kontrolliert (Windhorst et al., 2008; 2010; 2011, 2017, Küster et al., 2023). Dies geschieht durch die InsP3Kinase-vermittelte Regulation von zytosolischen Calciumsignalen sowie durch die Vernetzung von Aktinfilamenten (s. Bild rechts und Ashour et al., 2015).

Die Überexpression von ITPKA in Lungenkarzinomzellen wird durch Fehlregulation des Repressor-Element-1-Silencing-Transcription-Factor REST/NRSF induziert (Chang et al., 2011). Dieser Transkriptionsrepressor führt normalerweise zur Repression von nicht-neuronalen Genen in nicht-neuronalem Gewebe. In vielen Tumorzellen ist REST/NRSF fehlreguliert, so dass es zur Expression von neuronalen Genen kommt. Tumorzellen nutzen neuronale Proteine u.a. zur autokrinen Stimulation und verbesserten Migration und Invasion.

Es gelang uns bereits Hemmstoffe gegen die InsP3Kinase-Aktivität zu identifizieren, von denen BIP-4 (Schröder et al., 2013; 2015; Paraschiakos et al., 2021) als Leitstruktur verwendet werden kann, um Medikamente zu entwickeln, die eine Hemmung der InsP3Kinase-Aktivität in Tumorzellen bewirken.

Zurzeit arbeiten wir daran, Hemmstoffe gegen die Aktin-Crosslinking-Aktivität von ITPKA zu suchen. Hierzu verfolgen wir zwei Ansätze (1) die Selektion von Sybodies (synthetische Nanobodies) gegen die Aktinbinde-Domäne von ITPKA, (2) die Identifizierung von „small molecules“ oder Peptidomimetics, die spezifisch die Interaktion zwischen ITPKA und Aktin blockieren.

Gibt es Master-Aktinbindeproteine, die essentiell für die Metastasierung von Tumorzellen sind?

Die meisten Tumorzell-Populationen sind heterogen und plastisch. Aus diesem Grund ist es schwierig, ein einziges Protein zu identifizieren, das essentiell für die Metastasierung aller Tumorzellen in einer Population ist. Außerdem verändern sich Tumorzellen während der Metastasierung dramatisch (Schäfer et al., 2023). In der folgenden Abbildung ist diese Plastizität dargestellt:

Diese Tatsache erschwert die zielgerichtete Therapie von Tumorzellen durch Hemmung nur eines Proteins (z.B Her2 in Mammakarzinomzellen) und deshalb werden Krebspatient:innen in den meisten Fällen immer noch mit einer Kombination aus zielgerichteter- und Chemotherapie sowie durch Bestrahlung behandelt. Neuerdings werden auch Immuntherapien angeboten.

Da Tumorzellen während der Metastasierung darauf angewiesen sind, ihr Zytoskelett kontinuierlich auf- und abzubauen, benötigen sie unterschiedliche Aktinbindeproteine, die diesen Prozess vermitteln. Um zu prüfen, welches Aktinbindeprotein am stärksten in metastasierten Tumorzellen exprimiert ist, untersuchten wir in Kooperation mit der Gynäkologie und der Bioinformatik des UKE die mRNA Expression von Aktinbindeproteinen in Proben von Brustkrebspatientinnen. Hierbei stellte sich heraus, dass nur wenige Aktinbindeproteine signifikant in metastasierten Tumoren herauf reguliert sind. Die stärkste Korrelation zeigte das Aktinschneide-Protein Cofilin-1. Dieses Protein ist essentiell, um die Aktin-Dynamik in sich bewegenden Zellen aufrecht zu erhalten und spielt deshalb eine wichtige Rolle bei der Metastasierung.

Zurzeit analysieren wir Patientenproben per Western-Blotting um zu prüfen, ob Cofilin-1 wirklich in allen Proben von metastasierten Tumoren exprimiert ist. Sollte dies tatsächlich der Fall sein, werden wir im nächsten Schritt prüfen, ob die Cofilin-Expression auch während der Metastasierung konstant bleibt, oder sich in plastischen Zellen verändert. Falls wir finden sollten, dass Cofilin-1 tatsächlich von allen Zellen in einer Tumorzellpopulation und auch in allen Tumortypen exprimiert ist, wäre Cofilin-1 ein Master-Aktinbindeprotein und sein Hemmung sollte folglich die Metastasierung hemmen. Wahrscheinlicher ist allerding, dass Tumorzellen unterschiedliche Strategien nutzen, um zu metastasieren und deshalb auch unterschiedlicher Aktinbindeproteine exprimieren.

Die fehlerhafte Expression von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen steigert die chromosomale Instabilität von Tumorzellen

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Chromosomale Instabilität ist ein zellulärer Prozess bei dem entweder ganze Chromosomen oder Teile davon nach der Zellteilung ungleichmäßig auf die Tochterzellen aufgeteilt werden. Das kann zum „gain of function“ oder „loss of function“ führen, so das Tumorzellen z.B. Gene dazu gewinnen können, die für Onkogene codieren oder Tumorsuppressor-codierende Gene verlieren. Nach Selektionsdruck überleben also nur solche Tumorzellen, die ein optimal angepasstes Genom haben. Diese starke genomische Plastizität erlaubt es den Zellpopulationen sich immer wieder an neue Gegebenheiten anzupassen, was die Tumortherapie ungemein erschwert. Ein wichtiger Faktor, der zur chromosomalen Instabilität führen kann, ist eine fehlerhafte Regulation der Spindel-Mikrotubuli-Dynamik. Die mitotischen Spindelfasern binden die Chromosomen in der Metaphase und ordnen sie in der Äquatorial-Ebene an („aligned“, Bild rechts).

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Danach ziehen die Mikrotubuli die Chromosomen zu den Zellpolen und gewährleisten so, dass die Chromosomen gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden. Funktieren die Spindel-Mikrotubuli nicht richtig kann es passieren, dass die Chromosomen nicht korrekt angeordnet sind („not aligned“) und nachfolgend in der Anaphase nicht gleichmäßig zu den Zellpolen gezogen werden. Aus diesem Grund werden die Chromosomen ungleich zwischen den Tochterzellen aufgeteilt oder verbleiben im Zytosol. Die zytosolischen Chromosomen werden von einer Kernmembran umschlossen und etablieren sich als „Mikronuclei“ (s. Pfeile in Abb. rechts). Diese Mikronuclei können brechen, so dass sich DNA im Zytosol anreichert und eine Immunreaktion hervorruft. Die zytosolische DNA wird von der cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) erkannt und zyklisches GMP-AMP aktiviert nachfolgend den Stimulator of INterferon Genes (STING). Schließlich sezernieren Zellen mit hohen zytosolischen DNA Konzentrationen Interferone und stimulieren auf diese Weise vor allem T- und dendritische Zellen.

Aus diesem Grund ist es wahrscheinlich, dass chromosomal instabile Zellen zu einer Stimulation von Immunzellen führen und deshalb möglicherweise besser auf Immunzell-Therapien reagieren als chromosomal stabile Zellen. Zurzeit sind wir dabei diese Hypothese zu prüfen.

Regulation der Exosomen-Biogenese durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine

Exosomen sind kleine Vesikel, die von Zellen sezerniert werden, um Informationen an Nachbarzellen weiterzugeben. Im Fall von Tumorzellen kann die Tumormikroumgebung durch Exosomen so vorbereitet werden, dass sich Tumorzellen in fremden Geweben besser ausbreiten können. Zurzeit wird angenommen, dass die Exosomen-Biogenese mit der Einschnürung der Endosomen-Membran beginnt. Die Endosomen reifen dann zu „Multivesicular-Bodies“ (MVB), die intraluminale Vesikel (ILV) enthalten. Bestimmte MVB-Populationen verschmelzen schließlich mit der Plasmamembran und entlassen die ILV als Exosomen ins Medium. Interessanterweise wird bei der Bildung der ILV Material aus dem Zytoplasma (Protein, Nukleinsäuren und Metabolite) eingeschleust und über die Exosomen an Nachbarzellen abgegeben.

Wir konnten kürzlich zeigen, dass eine bestimmte posttranslationale Modifikation von Mikrotubuli dazu führt, dass einige MVB-Populationen schneller innerhalb der Zellen transportiert und entsprechend mehr Exosomen sezerniert wurden. Interessanterweise manipulierten diese Tumorzell-Exosomen Zellen der Blut-Hirn-Schranke derartig, dass sie durchlässiger wurde und Tumorzellen besser an ihnen haften konnten (Arnold et al., 2021).

Zurzeit untersuchen wir die Rolle eines weiteren Mikrotubuli-assoziierten Proteins bei der Biogenese von Exosomen. Dieses Protein scheint die Aktivität von ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport)-Proteinen in Tumorzellen zu stimulieren und damit die ILV-Synthese zu beschleunigen. Da das Protein nicht in normalen Zellen exprimiert wird, scheint es ein Tumorzell-spezifischer Promotor der Exosomen-Synthese zu sein. Zurzeit sind wir dabei diese Annahme zu überprüfen.

Zusammengefasst zeigen unsere Projekte deutlich, das Zytoskelett-assoziierte Proteine essentiell für unterschiedliche zelluläre Prozesse sind. Folglich gibt es vielfältige Möglichkeiten durch Hemmung solcher Proteine die Metastasierung von Tumorzellen zu hemmen.

• Klonierungen und Proteinreinigungen
• Extraktion von DNA, mRNA und Proteinen
• Enzymkinetische Assays
• Bestimmung der cytosolischen Calciumkonzentration
• Westernblotting, Immunpräzipitation, Immuncytologie und Histololgie
• Migrations- Invasions- und Adhäsions-Assays
• Transiente und stabile Überexpression sowie shRNA-vermittelte Herunterregulation von Proteinen.
• Diverse Techniken zur Analyse der Aktin- und Mikrotubuli Dynamik in zellfreien Systemen
• Fluoreszenzmikroskopie

Betreuung von Bachelor-, Master- und Doktorarbeiten.